从实验到田间：ARF基因调控机制为玉米育种带来新方向

从实验到田间：ARF基因调控机制为玉米育种带来新方向

在农业生产中
，，
，，玉米作为全球广泛种植的重要农作物，，，，其籽粒性状直接影响产量、
、、品质及收获储存等环节。。硬粒玉米籽粒偏小但硬质胚乳丰富，，，容重高
、、、脱水快且耐储运；而马齿型玉米籽粒较大，，，，却因上部胚乳灌浆不足导致籽粒上部塌陷，，，，粉质胚乳占比高，，，，脱水慢
、
、
、、容重低，，，
，给机械收获和长期储藏带来不便。
。长久以来，，育种专家期望培育兼具马齿型大籽粒与硬粒型优良物理特性（如浅马齿
、
、、、硬粒外观
、、、高容重、、、
、快速脱水、
、适合机械收获）的品种，
，，但由于这两种性状受母体基因型控制且由多个微效基因调控，，
，，构建遗传研究群体难度极大
，，，，当代基因型需通过下一代籽粒表型判断，，，导致控制马齿型向硬粒型转变的关键基因长期未被克隆，，，，研究进展缓慢。。。

今天和大家分享一篇关于玉米籽粒性状转变奥秘的文章，，该文章于2024年3月发表在Nat Commun杂志上，，文章标题为“An ARF gene mutation creates flint kernel architecture in dent maize”。。。。

01研究思路

该研究以玉米籽粒性状改良为目标，，通过系列实验技术层层推进揭示ARFTF17突变塑造硬粒表型的机制
：首先利用EMS诱变技术构建B73突变体库，，结合表型观察与参数测量（如籽粒形态、
、、硬质胚乳占比、、脱水速率等）筛选获得硬粒表型突变体fka1-1
；通过BSA测序技术定位候选基因，
，，，借助等位测试、、CRISPR/Cas9 基因编辑及转基因互补实验验证ARFTF17为关键调控基因。。在细胞学机制解析中，
，采用半薄切片光学显微镜观察和透射电子显微镜（TEM） 分析果皮细胞长度、、数量及形态变化
，，
，明确果皮发育异常与表型的关联
。。
。。分子机制探究中，
，，，通过RNA-seq 转录组分析筛选差异表达基因（如 PIN1、、、CHS
、、
、DFR），，
，代谢组学技术鉴定类黄酮等差异代谢物
；利用双分子荧光互补（BiFC）、
、荧光素酶互补成像（LCI）和 pull-down 实验验证ARFTF17与MYB40的互作
，，，通过凝胶阻滞实验（EMSA） 检测蛋白与基因启动子的结合，
，，，双荧光素酶报告基因（LUC）实验解析基因表达调控关系，，，
，结合RT-qPCR和免疫印迹（Western blot） 验证基因转录与蛋白水平变化
。。遗传验证阶段，，，，通过MYB40 过表达、、RNA干扰及PIN1突变体实验确证通路功能；最终在育种应用评估中，，，利用田间实验结合籽粒抗破损性测试
、、、、含水量及产量测定，，证实 ARFTF17 突变在不同遗传背景下的改良效果
。。
。。这些实验技术的综合应用，，，从表型筛选
、、、
、基因克隆到机制解析与应用验证，，构建了完整的研究闭环，
，，揭示了 ARFTF17 通过调控生长素和类黄酮代谢影响玉米籽粒表型的新机制。。。

02主要研究内容

（1）FKA1 编码 ARF 转录因子 ARFTF17

为克隆控制fka1-1突变体硬粒表型的基因，，研究人员将其与野生型B73杂交构建F2群体，，，
，发现 F3籽粒马齿与硬粒表型分离比约为3:1，，，
，表明该表型由单隐性基因控制；通过BSA测序定位5号染色体27-29 Mb区间
，，，其中仅Zm00001d014013存在C→T突变，，
，导致翻译提前终止，，该基因编码ARF 转录因子ARFTF17
。。。RT-qPCR和GFP报告基因实验显示ARFTF17在发育种子的果皮中高表达
，，
，蛋白在果皮中积累量更高
，，而突变体果皮中其转录和蛋白水平显著降低，，为无效等位基因
。。进一步通过另一个EMS等位突变体fka1-2（同基因终止突变）的杂交实验，，以及ARFTF17转基因互补实验，，
，最终证实Zm00001d014013（ARFTF17）突变是硬粒表型的成因。。。。

（2）ARFTF17 通过与 MYB40 相互作用调控下游基因

为探究ARFTF17调控下游基因的分子机制，，，研究首先通过瞬时表达实验观察到ARFTF17-eGFP定位于细胞核
，
，，符合转录因子的特征；但凝胶阻滞实验（EMSA） 显示，
，ARFTF17无法结合DR5启动子或含生长素响应元件（TGTCTC）的 P3 (2x) 片段
，，
，结合DNA 亲和纯化测序（DAP-seq） 结果（C族ARF无特异性结合峰），，
，推测其可能通过与其他转录因子互作调控基因表达。。。鉴于ARFTF17 突变体中类黄酮合成基因显著上调，，
，而该通路受玉米P基因家族调控，，
，，结合RNA-seq 数据筛选出果皮中高表达的MYB40（其他家族成员不表达或功能异常），，，，进而通过双分子荧光互补（BiFC）、、荧光素酶互补成像（LCI）及 pull-down实验，
，，，证实ARFTF17与MYB40存在直接相互作用。。。。为明确功能关系，，，采用双荧光素酶报告基因（LUC）实验发现，，，MYB40可激活CHS和DFR启动子的转录活性，，而ARFTF17与MYB40共表达时，，，，这种激活作用被显著抑制；EMSA实验进一步验证，，MYB40（而非 ARFTF17）能结合 CHS和DFR启动子中的P1核心motif
。。综上，，，ARFTF17通过与MYB40互作，，抑制其对下游类黄酮合成基因（CHS、、、、DFR）的转录激活功能，，，，从而调控相关通路。。

（3）ARFTF17-MYB40 模块调控硬粒型籽粒结构

为验证ARFTF17-MYB40模块调控籽粒结构的功能，
，在B73中过表达MYB40，，，转基因株系表现出与ARFTF17突变体相似的硬粒表型（顶部凸圆、、、硬质胚乳增多、、、果皮缩短）。
。。。通过RNAi沉默MYB40 后，，，ARFTF17突变诱导的硬粒表型被抑制
，，
，
，表明MYB40是ARFTF17功能依赖的关键因子。。。MYB40过表达导致果皮IAA含量下降、、PIN1表达下调，，，EMSA和LUC实验证实MYB40可直接结合并抑制 PIN1启动子活性，
，，，而ARFTF17可部分解除这种抑制。。
。从MEMD数据库筛选到的PIN1突变体也表现出硬粒表型，
，且IAA含量降低。。综上，，，，ARFTF17突变增强MYB40功能，
，
，，通过抑制PIN1表达和促进类黄酮合成（CHS/DFR），，降低果皮IAA水平，，最终导致硬粒型籽粒形成。。。。

03参考文献

Wang H, Huang Y, Li Y, et al. An ARF gene mutation creates flint kernel architecture in dent maize. Nat Commun. 2024, doi: